Nel momento in cui � munto dalla mammella di un animale sano, il latte contiene microrganismi che sono penetrati nei canali galattofori attraverso i pori lattiferi; essi vengono asportati meccanicamente durante la mungitura. Il numero dei microrganismi presenti al momento della mungitura � compreso fra parecchie centinaia e parecchie migliaia al millilitro; i conteggi variano fra le vacche e fra i quarti della mammella della stessa vacca e sono massimi durante le fasi iniziali della mungitura. Dal momento in cui il latte lascia la mammella fino a quando � distribuito in recipienti, tutto ci� con cui viene a contatto � una sorgente potenziale d’altri microrganismi. Il mancato rispetto delle pratiche igieniche d� come risultato un latte fortemente contaminato che si altera con rapidit�, mentre la mungitura eseguita in condizioni igieniche rigorose d� un prodotto con un basso tenore batterico e con un lungo tempo di conservazione.

LA VACCA La salute del bestiame bovino da latte ha un'importanza fondamentale. Il latte munto asetticamente da un animale sano contiene un piccolo numero di batteri, i quali sono del tipo saprofita e hanno una scarsa importanza finch� il loro accrescimento � inibito. Invece, il latte munto da una vacca con una mammella infetta contiene probabilmente un grande numero di batteri che sono paragona. Si rende pertanto utile il controllo veterinario periodico di ciascun animale.

L'AREA DI MUNGITURA Il contenuto microbico dell'aria che pu� contaminare il latte, � influenzato da molte condizioni. Il mantenimento di un'area pulita e la riduzione al minimo delle attivit� che creano polvere riduce il potenziale di contaminazione.

APPARECCHIATURA PER LA MUNGITURA La pi� importante sorgente di contaminazione del latte � l'interno dell'apparecchiatura con cui entra in contatto. Le mungitrici meccaniche, i bidoni del latte, le tubazioni, le cisterne ed altre apparecchiature, se non vengono pulite e sterilizzate con appropriati agenti fisici o chimici, possono essere una sorgente di grave contaminazione.

MICRORGANISMI

Ci occuperemo di microrganismi appartenenti ai seguenti gruppi, di cui riassumiamo le principali caratteristiche:
BATTERI (PROCARIOTI) Organismi monocellulari microscopici (0,3-10,um); non c'� formazione di organismi che comprendono pi� cellule differenziate. Forma esterna apparentemente semplice. La cellula non contiene un nucleo differenziato ed � limitata da una parete rigida composta da glicopeptidi. Moltiplicazione abitualmente asessuata, per scissione (divisione simmetrica della cellula). La durata di una generazione pu� essere motto breve, fino a 15 minuti, da qui la pullulazione, la tendenza all'ubiquit�. Alcuni batteri possono moltiplicarsi con la formazione di una spora per cellula: � una "forma di resistenza".Esistono vari tipi fisiologici. 1 batteri che vivono in terreni contenenti sostanze organiche, come il latte, sono eterotrofi; sono pi� o meno esigenti, per quanto riguarda le sostanze nutritive. Si ritrovano tutti i tipi di respirazione nella microflora dei latte: aerobiosi (vivono in presenza di ossigeno), anaerobiosi (vivono in assenza di ossigeno) e tipi facoltativi.

VIRUS Microrganismi infra-microscopici, troppo piccoli per essere visibili al microscopio Ottico (meno di 0,2 micron). Sono parassiti intracelluari obbligati degli animali e dei vegetali. Sono formati da un involucro proteico contenente un acido nucleo; il modo di riprodursi � mai conosciuto: si tratta di una replicazione.I virus che sono parassiti dei batteri vengono chiamati "batteriofagi" o semplicemente fagi Sono i meglio conosciuti tra gli ultramicroscopici; hanno la forma di una tetrade e si attaccano con la coda alla cellula, d� cui perforano la parete e nellaquale iniettano il loro acido ribonucleico come una siringa. I fagi esercitano un ruolo importante nelle industrie che utilizzano i fermenti lattici. Tra i batteri e i virus vi � il gruppo Rickettsia che si avvicina ai grossi virus; alcune specie hanno un significato igienico nel latte.

LIEVITI E MUFFE (EUCARIOTI) Microrganismi attribuiti al regno vegetale a causa della loro struttura cellulare; la cellula � circondata da cellulosa e contiene un nucleo ben differenziato.I lieviti sono generalmente unicellulari I lieviti imperfetti (Cryptococcaceae), non hanno che un tipo di moltiplicazione asessuata: la gemmazione. I lieviti perfetti si riproducono formando degli aschi dopo coniugazione; gli aschi contengono molte ascospore (Endomyce�aceae). Le attivit� biochimiche dei lieviti li avvicinano a certi batteri eterotrofi, ai quali a volte vengono associati.Le muffe sono in genere pi� complesse nella loro morfologia e nel loro modo di riproduzione. Lieviti e muffe sono accolti facoltativi; crescono pi� facilmente in di aria. La sensibilit� di questi agli agenti antibatterici, ed in particolare agli antibiotici, � diversa da quella dei batteri. Al contrario, la loro sensibilit� al calore � dello stesso ordine di quella dei batteri non sporigeni (le ascospore non sono termoresitenti).

PRINCIPALI GRUPPI DI BATTERI DEL LATTE

Possono essere distinti due grandi gruppi di batteri grazie al metodo della colorazione di Gram I batteri "Gram + " sono caratterizzati da esigenze nutrizionali pi� grandi e da una sensibilit� pi� elevata agli agenti battericidi rispetto ai batteri "Gram -". Questi ultimi sono tuttavia pi� sensibili a certe sostanze inibitrici che i batteri "Gram + ". Ricordiamo che le sostanze inibitrici arrestano la crescita senza distruggere i batteri, per esempio: sodio azide, telluriti, acetato di tallio. Queste propriet� permettono di preparare dei terreni selettivi, facilitando l'isolamento dei batteri che appartengono ad una di queste categorie.

BATTERI GRAM ⁺ 1) I batteri latticiI batteri pi� importanti nei prodotti lattiero-caseari, sia per la loro attivit� biochimica che per il loro numero (proporzione nella microflora totale e frequenza nelle analisi), sono quelli che fermentano il lattosio dando una quantit� elevata di acido lattico, tra i prodotti di degradazione, e che sono solo debolmente proteolitici. Appartengono alla famiglia delle Lactobacillaceaceae e delle Streptococcaceae .2) Micrococchi e StafilococchiEssendo ben note le loro caratteristiche morfologiche assai particolari, la riunione dei batteri a forma sferica in una sola unit� di classificazione � stata realizzata nella parte 14 dei Bergey's Manual, malgrado le differenze notevoli nei caratteri fisiologici.La famiglia delle Micrococcaceae raccoglie specie interessanti in caseificio, tutte catalasi + e resistenti al sale (5% di Nacl) Ecco i principali caratteri distintivi:a) MicrococchiQuesti batteri sono aerobi stretti (metabolismo respiratorio); non fermentano il glucosio degradano questo zucchero e non provocano che un debole abbassamento dei pH (minimo tra 5,0) e essi utilizzano anche l'acetato e il lattato come fonte di carbonio I micrococchi non sono patogeni; sono privi di coagulasi e di emolisina si ritrovano tuttavia frequentemente sulla pelle dell'uomo e degli animali. I micrococchi fanno parte della flora banale di contaminazione dei latte; vi si trovano con frequenza fin dalla mungitura. Per il fatto di avere un ottimo di temperatura molto elevato (circa 37�C) ed attivit� enzimatiche ridotte, non hanno che un ruolo minore nei problemi posti dalla conservazione e dal trattamento dei latte. Si isolano dal latte dei micrococchi che non attaccano il lattosio. Certe specie hanno attivit� proteolititici e possono alcalinizzare il mezzo; questa attivit� presenta interesse da un punto di vista particolare, quello della "maturazione" del latte di caseificio.I micrococchi influiscono sul risultato delle prove di valutazione della qualit� batteriologica dei latte, che vengono abitualmente eseguite a 37�Cb) Stafilococchi.Questi batteri sono aero-anaerobi facoltativi; provocano una fermentaz�one acidificante dei glucosio, con abbassamento notevole dei pH (verso 4,3-4,5); producono acetoina (reazione di Voges-Proskauer positiva), contrariamente ai micrococchi. Crescono in una larghissima zona di pH, da 4,2 a 9,3. 1 microbiologi deg!i alimenti distinguono due gruppi:- Stafilococchi patogeni che possiedono spesso una coagulasi; vengono considerati patogeni se hanno questi due caratteri positivi: DNasi e fosfatasi, che sono legati alla produzione di enterotossine (di cui riparleremo in seguito). Una sola specie � riconosciuta oggi: Staphylococcus aureus che comprende contemporaneamente gli stafilococchi "dorati" e gli stafilococchi non pigmentati (in precedenza designati: S. albus).- Stafilococchi non patogeni, sempre coagulasi -negativi e senza tossine (in batteriologia medica S. epidermitis viene considerato come agente di seconda contaminazione).3) Batteri sporigeni (Bacillaceae)Questi batteri sono i soli a formare una endospora che ha la propriet� molto importante di resistere a temperature elevate. Mentre i batteri non sporigeni vengono in genere distrutti al di sotto degli 80�C, gli sporigeni non sono uccisi che al di sopra dei 100�C. Hanno, per questo motivo, una grande importanza tecnologica per quanto riguarda tutte le conserve d� prodotti alimentari, non trattate con agenti conservanti.Nonostante la termoresistenza, dovuta alle spore, molti di questi batteri sono mesofili, cio� si sviluppano intorno ai 30�C e vengono inibiti a temperature superiori a 45�C. Esistono specie termofile che si sviluppano bene al di sopra dei 60�C.Questi batteri non si manifestano che raramente nel latte crudo e nei prodotti lattiero-caseari che non sono stati riscaldati. Al contrario, sono responsabili dell'alterazione dei latti bolliti o insufficientemente sterilizzati, dei formaggi fusi, dei formaggi a pasta cotta, dei latti concentrati.Il riscaldamento ha per risultato una selezione di questi germi quando inizialmente presenti in quantit� notevole. In presenza di batteri lattici questi vengono rapidamente inibiti.Si trovano nei prodotti lattiero-caseari dei rappresentanti di due dei cinque generi (secondo il Bergey's Manual):- Bacillus, batteri sporigeni aerobi stretti o anaerobi facoltativi, aventi attivit� enzimatiche varie: acidificazione, coagulazione, proteolisi.- Clostridi batteri sporigeni anaerobi stretti (si sviluppano solo in mezzi privi di ossigeno); sono dannosi in caseificio soprattutto per la produzione di gas; alcuni sono pericolosi per le loro tossine, in particolare Clostridium perfringens.4) Batteri Gram ⁺ diversi. a) Il latte fresco pu� contenere molti batteri del genere Corynebacterium: sono bastoncini sottili, si presentano in raggruppamenti caratteristici. Questi batteri hanno poca importanza pratica per il fatto che hanno attivit� poco marcate ed un ottimo di temperatura molto elevato: 37�C.b) Propionibacterium, batteri propionici, che hanno un ruolo nella maturazione dei formaggi a pasta dura.e) Brevibacter�um batteri a forma di corti bastoncini (coccoidi) che s� trovano spesso nelle sostanze animali o vegetali in decomposizione. Non lamentano il lattosio. B. linens � abbondante sullo strato rosso vischioso alla superficie dei formaggi stagionati in atmosfera umida.

BATTERI GRAM ^_ ANAEROBI FACOLTATIVI 1) Le enterobatteriaceeLa famiglia delle Enterobacteriaceae � una delle pi� ampie e difficili da suddividere. Le specie pi� frequenti nei prodotti lattiero-caseari sono quelle che fermentano il lattosio, ma si ritrovano anche le altre. La maggior parte delle enterobatteriacee sono ospiti normali dell'intestino dei mammiferi; la loro presenza nell'acqua o nel latte � da far risalire ad una contaminazione d'origine fecale Molte di queste specie hanno una fase di vita libera nel suolo e nell'acqua; alcune si ritrovano sui prodotti vegetali.Nel latte le enterobatteriacee sono spesso meno numerose, di altri batteri Gram negativi; hanno tuttavia grande importanza da due punti di vista:igienico: molte specie di questa famiglia sono responsabili di malattie infettive, che possono avere carattere epidemico; nel caso dei prodotti lattiero-caseari le salmonelle sono quelle maggiormente temibili; ad altre specie vengono attribuite infezioni gastro-intestinali benigne, salvo che nei bambini;- tecnologico: una propriet� biochimica delle enterobatteriacee � la fermentazione degli zuccheri con produzione di gas (gas carbonico ed idrogeno) e di acidi; alcune specie producono sostanze viscose e sostanze dal sapore sgradevole. Questa importanza � accresciuta dalla facolt� di svilupparsi a temperature molto diverse (certe specie si sviluppano tra i 10�C e i 40�C, Escherichia coli pu� crescere fino a 44�C) e per la resistenza ad antibiotici che si trovano occasionalmente nel latte. Le enterobatteriacee possono in questa condizione soppiantare i batteri lattici ed invadere il mezzo. Il termine batteri coliformi � stato utilizzato per designare le enterobatteriacee pi� frequentemente riscontrate nei prodotti lattiero-caseari. La conta di questi batteri (colimetria) � uno dei mezzi pi� significativi per valutare la qualit� igienica del latte e l'efficacia dei trattamenti di risanamento che il latte ha subito. Si utilizzano, a questo scopo, terreni di coltura resi selettivi con aggiunta di sostanze che inibiscono la maggior parte delle altre specie, il verde brillante, la bile, il desossicolato di sodio ecc. a) Escherichia. Questo genere non comprende pi� che una specie ben definita: E. coli con molte variet� che hanno caratteristiche antigeniche differenti. Produce indolo; poich� la messa in evidenza di questa sostanza � semplice, � diventata il principio di una reazione di caratterizzazione; il suo significato � ridotto perch� batteri completamente differenti (Proteus Aeromonas) sono in ugual misura produttori di indolo. Produce molto gas e acidi organici (lattico, acetico, succinico ... ). E' tuttavia meno "acidificante" dei batteri lattici ed � inibita in loro presenza quando il pH scende al di sotto di 5,0-5,2. Come tutte le enterobatteriacee, l’E. coli riduce i nitrati in nitriti; in presenza di nitrati la produzione di gas � limitata. b) Enterobacter. Questo genere era un tempo designato come Aerobacter, poi con Cloaca. E. aerogenes � anche un forte produttore di gas nei prodotti lattiero-caseari, ma non causa che una debole acidificazione; al contrario produce una sostanza neutra, l'acetoina Questi batteri non sono patogeni. c) Klebsiella. Genere vicino al precedente ma, all'opposto degli altri batteri coliformi, le cellule sono immobili e capsulate; comprende ceppi saprofiti e ceppi patogeni (pneumobacillo). d) Citobacter. Microrganismi un tempo classificati con Escherichia (E. freundii); specie banali delle sostanze fecali, caratterizzate dalla produzione di H₂S (non tutti i ceppi). Al di fuori dei coliformi si possono ritrovare nel latte enterobatteriacee che non fermentano il lattosio, sia delle specie banali: Serratia Proteus che sono proteolitiche, sia delle specie patogene temibili: Salmonella (bacillo dei tifo), e pi� raramente Shigella (bacillo della dissenteria). 2) Generi affiniIl genere Flavobacterium contiene delle specie che crescono di preferenza a bassa temperatura e non si sviluppano al di sopra di 30 �C. Possiedono un metabolismo respiratorio e dunque non fermentano il lattosio. Il genere Aeromonas comprende specie acquatiche che si trovano spesso nel latte. Fermentano gli zuccheri e producono indolo, come quelle del genere Escherichia, e ci� pu� provocare confusione al momento dell'analisi dei latti pastorizzati. L'ottimo di temperatura si situa verso i 30 �C

BATTERI GRAM ^– AEROBI STRETTI 1) Alcaligenes Questi batteri sono molto frequenti nel latte crudo, che non modificano affatto, perch� non fermentano gli zuccheri; il latte non coagulato pu� diventare alcalino. Nessuna specie � sospetta dal punto di vista igienico Questi batteri presentano dell'interesse perch� formano una parte della microflora psicrotrofa, che si moltiplica nel latte conservato a bassa temperatura. 2) Brucella.Batteri patogeni per l'uomo e per gli animali, agenti della brucellosi che possono contaminare il latte.

INFLUENZA DELLE SOSTANZE DELLE SOSTANZE ANTIBATTERICHE SULLA MICROFLORA DLE LATTE E SUI BATTERI LATTICI

a) latte crudoLa microflora di contaminazione del latte dopo la mungitura non si sviluppa spesso che dopo un certo tempo di conservazione a temperatura ambiente e la fase battericida. Questa fase ha una certa durata, molto variabile a seconda dei campioni di latte di vacca; a volte � di parecchie ore ma a volte � molto breve in certi casi si osserva una diminuzione del numero di microrganismi poche ore dopo la mungitura; si tratta probabilmente di una conseguenza dell’agglutinazione; alcuni microrganismi sfuggono alla conta batterica.b) latte pastorizzatoGli inibitori naturali del latte di vacca non vengono distrutti dalla pastorizzazione classica. Il latte pastorizzato in questo modo possiede generalmente una migliore conservazione del latte scaldato ad una temperatura di poco pi� alta. Molti batteri del latte pastorizzato si sviluppano meglio nel latte che ha subito un trattamento termico sufficiente per distruggere la lattoperossidasi.

INFLUENZA DELLA TEMPERATURA SULLO SVILUPPO E SULL’ATTIVITA’ DEI BATTERI

A) Effetto quantitativoQuale che sia la composizione della microflora originale del latte o di altri prodotti lattiero-caseari liquidi, si osserva un’accelerazione dello sviluppo microbico, dunque un aumento della microflora totale, quando si eleva la temperatura di conservazione fin verso i 35-40�C. Al di sopra si osserverebbe al contrario un rallentamento. Pi� la temperatura � bassa, pi� la moltiplicazione microbica viene rallentata nel latte.B) Effetto qualitativoNon sono le medesime specie che predominano alle differenti temperature di conservazione o di trattamento. La temperatura esercita un ruolo selettivo importante che viene messo a profitto nelle industrie lattiero-casearie:1) Alle temperature medie, da 20 a 37�C, � in generale la microflora lattica mesofila che invade il latte e provoca la sua coagulazione per acidificazione, soprattutto gli streptococchi; i batteri coliformi, che sono tolleranti alle variazioni di temperatura, possono ugualmente intervenire.2) Alle temperature relativamente basse tra 5 e 15�C una "microflora psicrofila" prende il sopravvento; essa � costituita da batteri Gram- molto diversi, di cui abbiamo parlato precedentemente, tra i quali si trovano dei microrganismi proteolitici e lipolitici Il latte si altera lentamente.3) Alla temperatura di 40�C si selezionano le specie termofile; nel latte coagulato per la produzione dei gruy�re si favoriscono, verso i 50�C, i lattobacilli.Nei latti pastorizzati si trovano a volte micrococchi e stafilococchi resistenti. Nel latte bollito o insufficientemente sterilizzato le specie sporigene (Bacillus e Clostridia formano la parte essenziale della microflora.Vi � da fare una riserva che riguarda la tolleranza alle variazioni di temperatura di alcune specie, principalmente di batteri indesiderabili nel latte, come quelli dei genere Alcaligenes, il cui sviluppo � ancora notevole a 10’ e a 37�C, o E. coli, a 20' e a 40�C. Altre specie esigenti non si sviluppano bene che in una zona stretta, a pi� o meno 5�C attorno all'optimum: � il caso dei batteri lattici industriali.Per quanto riguarda le attivit� dei batteri, bisogna considerare l'effetto delle variazioni di temperatura sulla velocit� delle reazioni enzimatiche. 1 sistemi enzimatici microbici hanno a volte un ottimo di attivit� in una zona di temperatura che non � quella della moltiplicazione attiva: � soprattutto il caso della proteasi di Bacillus e Proteus; sono pi� attive ad una temperatura inferiore a quella dei massimo di crescita. Esiste anche la situazione inversa: le proteasi di alcuni batteri psicrotrofi sono pi� attive a 30�C che a 10�C; a volte esse sono anche termoresistenti.

OSSERVAZIONI SULL’ ALTERAZIONE DEL LATTE

Difetti microbici Molte caratteristiche li distinguono dagli altri: 1) Le condizioni di sviluppo non esistono nel latte alla mungitura i microbi responsabili non si trovano nella mammella sana. 2) I difetti si aggravano coi passare del tempo. 3) Possono essere trasmessi per inoculo da un latte all'altro. 4) Il calore (pastorizzazione, sterilizzazione) che distrugge i microbi responsabili impedisce la comparsa dei difetto. 5) Una data alterazione � spesso provocata non da una sola specie, ma da un’associazione di specie. D'altra parte, una trasformazione, vista nel suo insieme, pu� essere provocata, a seconda dei casi, da specie a volte molto lontane le une dalle altre. Nella pratica si conosce una trasformazione microbica dei latti con certi aspetti o propriet� caratteristiche, prima di conoscere la o le specie batteriche in gioco. 6) L'acidificazione dei latti si oppone ad altre alterazioni. I fermenti lattici inibiscono i microrganismi che si sviluppano di preferenza nei mezzi neutri o poco acidi; essi forniscono una protezione contro numerosi microrganismi proteolitici. L'aggiunta al latte od al siero di un agente neutralizzante fa scomparire questa protezione; pu� dunque avere degli effetti nefasti.

Nel caso del latte di consumo, tutte le alterazioni costituiscono un difetto, non � lo stesso per i derivati del latte. La produzione di alcuni di essi dipende dall’attivit� microbica. Essi sono tuttavia interessati a difetti microbici.

PROPRIETA’ GENERALI DEI BATTERI LATTICI

IMPORTANZA DEI BATTERI LATTICI

L'importanza pratica dei batteri appartenenti a questa famiglia � notevole, per molteplici ragioni: 1) Produzione di acido ed abbassamento dei pH:- protezione delle sostanze alimentari dovuta all'inibizione dei batteri della putrefazione in mezzo acido;- instaurazione di condizioni fisico-chimiche favorevoli a diverse trasformazioni nell'industria lattiero-casearia: spurgo delle cagliate, burrificazione;- fermentazione lattica "aromatizzante", che permette di ottenere prodotti acidi con un sapore ricercato; panna, burro, yogurt.;- propriet� igieniche derivanti dalle qualit� antisettiche intestinali dell'acido lattico;- produzione industriale dell'acido lattico. 2) Altre attivit� che possono avere effetti utili o nocivi:- produzione di enzimi che intervengono nella degradazione delle proteine, specialmente della caseina nel corso della maturazione dei formaggi;- produzione di sostanze inibenti responsabili della selezione delle specie; - produzione di viscosit�, di gas (gonfiore), di macchie di ruggine ecc. 3) Potere patogeno posseduto da qualche specie. 4) Dosaggio microbiologico delle vitamine o degli aminoacidi, mettendo a profitto le esigenze nutrizionali dei batteri lattici.

CARATTERISTICHE ESSENZIALI

Sono batteri sferici o allungati, isolati o raggruppati in corte catene, immobili, non sporigeni, Gram +, catalasi. Non possiedono la citocromossidasi. Sono anaerobi facoltativi, sopportano ridotte pressioni di ossigeno; crescono poco sulla superficie dei mezzi di coltura usuali crescono pi� facilmente in profondit�; in generale la coagulazione dei latte inizia dal fondo. Non riducono i nitrati.

ESAME MICROBIOLOGICO DEL LATTE

Le indagini microbiologiche hanno lo scopo di accertare se il latte proviene da animali sani oppure ammalati o per i quali sia in corso una cura per l'apparato mammario; se � idoneo ad essere utilizzato in quanto la carica microbica totale rientra nella normalit�, - se infine contiene germi che per la loro natura possono compromettere i trattamenti che su di esso si effettueranno, o ne consentono la trasformazione. I metodi d’analisi e le caratteristiche per il controllo dei vari tipi di latte, crudo e trattato termicamente sono riportate nella O.M. 1011011985 e nel D.M. 26/3/1992 Suppl. G.U. no. 90, 16/4/1992 in attuazione della decisione no 91/180/CEE

Con l’applicazione della normativa in ottemperanza alle direttive CEE, � utile rilevare

che per la prima volta, viene fatta esplicita menzione dei criteri di precisazione da adottare

per i vari procedimenti. Essi vengono cos� identificati e definiti:

Ripetibilit� (r): � il valore al di sotto del quale dovrebbe cadere la differenza assoluta tra

due singoli risultati di prova ottenuti con lo stesso procedimento su campioni di materiali

identici nelle stesse condizioni (stesso operatore, stessa apparecchiatura, stesso laboratorio e a breve distanza di tempo)

Riproducibilit� ( R ): � il valore al di sotto del quale dovrebbe cadere la differenza assoluta tra due singoli risultati di prova ottenuti con lo stesso procedimento su campioni di materiali identici, in condizioni differenti (differenti operatori, differenti apparecchiature, differenti laboratori e/o tempi).

Ugualmente, per la prima volta, viene fatto esplicito riferimento alla "relazione d'analisi alla quale vengono date specifiche indicazioni sui contenuti e sulla rilevanza tecnico-scientifica della corretta elaborazione della stessa.