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ESAME QUANTITATIVO DEI BATTERI PRESENTI NEL LATTE FRESCO E IN QUELLO PASTORIZZATO La carica microbica del latte, prevalentemente costituita da batteri, risulta un fattore di primaria importanza igienico-sanitaria, dato che l'alimento � facilmente deteriorabile ed � potenziale fonte di malattie infettive. Il mezzo pi� idoneo per disinfettare il latte � costituito dalla pastorizzazione, trattamento con calore in grado di eliminare tutti i microrganismi patogeni. Ne risulta che nel latte fresco i coliformi sono sempre presenti, il loro riscontro nel latte pastorizzato sia invece a significare che il latte � stato contaminato dopo il processo di pastorizzazione. Per poter determinare il numero dei batteri presenti nel latte si possono usare due metodi che presentano allo stesso tempo dei vantaggi e degli svantaggi. Per il latte che si presume contenga pochi batteri, il metodo di inclusione in piastra risulta pi� sensibile e d� i risultati pi� precisi, mentre per il latte ad alta carica batterica � preferibile usare il metodo della conta microbica diretta. Entrambi i metodi sono indicativi di come il latte � stato raccolto, trattato e immagazzinato; si tratta di informazioni estremamente significative da un punto di vista igienico-sanitario. Tecnica di esecuzione Metodo di inclusione: La semina diretta in piastra di agar desossicolato un metodo sia selettivo che differenziale per evidenziare l'eventuale presenza di coliformi nel latte. Questo terreno inibisce, infatti, la crescita della maggior parte dei batteri ad eccezione dei coliformi e dei tipi affini I coliformi che fermentano il lattosio appaiono come colonie rosse che possono sere facilmente individuate e contate. Quei batteri che non fermentano il lattosio appaiono invece come colonie biancastre. Metodo della conta diretta microbica
Foto n� 25 : Semina di una piastra di Plate Count Agar DETERMINAZIONE DELLA CARICA MICROBICA Tecnica di esecuzione Preincubazione
Diluizione e semina del campione E' necessario innanzitutto procedere alla diluizione dei campione in esame utilizzando soluzione di Ringer 1: 4 sterile. li numero delle diluizioni decimali va scelto in base ai tipo di latte utilizzato, perch� � evidente che il latte pastorizzato, ad esempio, ha un contenuto microbico inferiore al latte crudo. Da ogni diluizione si trasferisce in piastra Petri sterile l mi di campione per il latte crudo o pastorizzato. Si allestiscono due piastre per ogni diluizione Aggiungere per ogni piastra 15 - 18 mi di Plate Count Agar (Tryptone Glucose Yeast Agar) addizionato di latte scremato in polvere (Milk Skim Powder: 10 gr/litro) fuso e raffreddato a circa 45�C. Mescolare il terreno per ottenere una distribuzione uniforme dei materiale e lasciare solidificare. Incubazione le temperature di incubazione differiscono per la ricerca dei germi psicrofili (21 <�C), della flora aerobica (30-32�C) e della flora termofila (55�C). Temperature e tempi di incubazione:
Foto n� 26: Metodo delle diluizioni Per il conteggio delle colonie si sceglieranno le piastre che contengono da 10 a 300 colonie. Naturalmente si terr� conto dei fattore di diluizione per rapportare il numero di colonie, e quindi di germi, al millilitro. NUMERAZIONE DEI COLIFORMI NEL LATTE PASTORIZZATO(Escherichia Coli), mentre in quello sottoposto a trattamenti termici d� risanamento evidenzia un’inefficacia o un successivo ulteriore inquinamento. La tecnica suggerita � quella della conta in piastra su terreno selettivo indicatore Violet Bile Lactose Agar (VRBL) con eccessiva eventuale conferma delle colonie in Brillant Green Lactose Bile Broth Tecnica di esecuzione Il campione di latte va mescolato capovolgendo il contenitore per almeno 25 volte. Ci� assicura l'omogenea distribuzione degli eventuali microrganismi. In asepsi, si prelevano 3 mi di campione di latte con una pipetta sterile. Sempre con le dovute precauzioni, si deposita il campione in tre piastre sterili in, ragione di 1 ml ciascuna. Tra il passaggio 1 e il passaggio 3 non devono intercorrere pi� di 3' Sul campione si versano 12 mi circa di VRBL Agar fuso e raffreddato a circa 45�C. Il terreno colturale appena versato va mescolato con il campione ruotando la piastra, per avere un’omogenea distribuzione delle colonie che si sviluppano. Tra la fine delle preparazioni dei campione e la miscelazione dall'aliquota di analisi con il terreno non devono trascorrere pi� di 15'. Si consiglia di preparare anche una piastra di controllo per la sterilit� dei terreno (che, naturalmente, non viene inseminata). Lasciar riposare le piastre su una superficie orizzontale pulita e fredda sino a quando il terreno non si sia solidificato. A solidificazione avvenuta, versare circa 4 ml di VRBL sulla superficie dei terreno inoculato; lasciar raffreddare. Trasferire le piastre in termostato capovolte e impilate (non pi� di 6 per pila); incubare a 30�C per 24 ore. Terminato il periodo di incubazione si effettua la lettura. Sul terreno VRBL Agar, sono caratteristiche dei coliformi le colonie di colore rosso scuro con un diametro di circa 0,5 con o senza precipitato intorno. Si prendono in considerazione solo piastre contenenti pi� di 150 colonie. numero dei coliformi in 1 mi di latte pastorizzato � dato dalla seguente formula: e c/n dove E indica la somma C il numero delle colonie di coliformi per ogni piastra n il numero di ml di campione esaminato (3 ml) Quando, come risultato, si hanno pi� di cento colonie, il risultato � approssimato a due cifre significative. Quando la cifra da arrotondare � 5, si arrotonda in modo che la cifra mediatamente a sinistra sia pari. Se si ottengono conteggi con numero di colonie superiore a 150, indicare il risultato come numero probabile di coliformi in 1 ml di prodotto. Tutte le colonie o parte di esse non hanno un aspetto caratteristico � bene effettuare un saggio di conferma che cos� si esegue: S� prelevano colonie non caratteristiche con ansa metallica in asepsi. Le colonie prelevate si inoculano in provette contenenti BGLB Broth e campanella di Durham. Le provette cos� allestite si mettono ad incubare in termostato a 30�C per 24 ore. Lettura: si considerano positive quelle colonie che nel tubo di Durham producono gas. Nel caso dei saggio di conferma calcolare il numero di colonie di coliformi in base alla percentuale di colonie coliformi confermate.
Foto n� 27: Semina di una piastra di VRBL REDUTTASI Questo metodo fornisce solo indicazioni approssimative, ma pu� dare velocemente un’idea delle condizioni igieniche di un campione di latte. Esso � basato sulla facolt� dei microrganismi di abbassare il potenziale d’ossidoriduzione del mezzo in cui si trovano in conseguenza delle loro attivit� metaboliche (consumo d’ossigeno e produzione di stanze riducenti). L'aggiunta di un indicatore redox (per esempio il blu di metilene o la resazurina) indica, con il suo cambiamento di colore, lo stato d’ossidazione o riduzione I mezzo. Il blu di metilene � azzurro in ambiente ossidato e incolore in ambiente ridotto: tanto pi� breve � il tempo di riduzione dell'indicatore (azzurro --> incolore) tanto elevata � la carica batterica presente e peggiore � la quantit�/qualit� del latte. REDUTTASI DEL BLU DI METILENE Preparazione del reattivo
Oppure:
Tecnica d’esecuzione
materiale deve essere sterile.
rispettivamente - 10 ml di latte + 1 ml d’acqua distillata. - 10 ml di latte riscaldato a 100�C per 10'+1 ml di soluzione di blu di metilene
della ricerca e leggere dopo 20' d’incubazione e quindi ogni ora. Tabella 19: Qualit� del latte in base al tempo di riduzione
Foto n� 28: Reduttasi del blu di metilene REDUTTASI DELLA RESAZURINA La resazurina si presenta di colore blu allo stato ossidato, rosa o incolore allo stato ridotto secondo lo stato di riduzione. Rispetto alla tecnica precedente, questa risulta pi� rapida. Preparazione del reattivo Sciogliere in bagnomaria bollente 0,1 g di resazurina in polvere in 200 ml d’acqua distillata. Conservare a + 4�C e diluire 1: 10 al momento dell'uso. Questa soluzione si conserva al buio per 24 ore. Tecnica di esecuzione
Lettura ed interpretazione dei dati: La lettura pu� essere fatta calcolando il tempo necessario per portare la resazurina dal blu al rosa oppure valutando le variazione intervenute dopo il tempo prefissato (10’). Nel primo caso si hanno valutazioni analoghe a quelle viste per la reduttasi al blu di metilene. Nel secondo, di largo impiego per la sua rapidit�, viene classificato decisamente scadente il latte che dopo 10’ ha assunto la colorazione rosa o rosa-malva, scadente o buono negli altri casi. E’ consigliabile usare un comparatore di colore per una maggiore attendibilit� del risultato. TABELLA 20 – RISULTATI DELLE ANALISI MICROBIOLOGICHE Data prelievo dei campioni: 14–02–2000 Data esecuzione analisi: 14–02–2000 Il numero si riferisce al numero di colonie; il segno ">" significa maggiore di 300 colonie.
TABELLA 21 – RISULTATI DELLE ANALISI MICROBIOLOGICHE Data prelievo dei campioni: 04–04–2000 Data esecuzione analisi: 04–04–2000 Il numero si riferisce al numero di colonie; il segno ">" significa maggiore di 300 colonie.
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